分光光度計介紹

簡介

分光光度法是在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度，對該物質(zhì)進行定性或定量分析。常用的波長范圍為：(1)200～380nm的紫外光區(qū)，(2)380～780nm的可見光區(qū)，(3)2.5～25μm（按波數(shù)計為4000cm<-1>～400cm<-1>）的紅外光區(qū)。所用儀器為紫外分光光度計、可見光分光光度計（或比色計）、紅外分光光度計或原子吸收分光光度計。為保證測量的精密度和準確度，所有儀器應按照國家計量檢定規(guī)程或本附錄規(guī)定，定期進行校正檢定。

儀器組成

分光光度計已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。

儀器主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、信號處理器和顯示與存儲系統(tǒng)組成。

光譜范圍

包括波長范圍為400~760 nm的可見光區(qū)和波長范圍為200～400 nm的紫外光區(qū)。不同的光源都有其*的發(fā)射光譜,因此可采用不同的發(fā)光體作為儀器的光源。

鎢燈的發(fā)射光譜:鎢燈光源所發(fā)出的400～760nm波長的光譜光通過三棱鏡折射后,可得到由紅橙，黃綠，藍靛，紫組成的連續(xù)色譜;該色譜可作為可見光分光光度計的光源。

氫燈（或氘燈）的發(fā)射光譜:氫燈能發(fā)出185～400 nm波長的光譜可作為紫外光光度計的光源。

物質(zhì)的吸收光譜：

如果在光源和棱鏡之間放上某種物質(zhì)的溶液,此時在屏上所顯示的光譜已不再是光源的光譜，它出現(xiàn)了幾條暗線,即光源發(fā)射光譜中某些波長的光因溶液吸收而消失，這種被溶液吸收后的光譜稱為該溶液的吸收光譜。

不同物質(zhì)的吸收光譜是不同的.因此根據(jù)吸收光譜,可以鑒別溶液中所含的物質(zhì)。

當光線通過某種物質(zhì)的溶液時透過的光的強度減弱，因為有一部分光在溶液的表面反射或分散，一部分光被組成此溶液的物質(zhì)所吸收只有一部分光可透過溶液。

入射光= 反射光 + 分散光 + 吸收光 + 透過光

如果我們用蒸餾水(或組成此溶液的溶劑)作為"空白"去校正反射，分散等因素造成的入射光的損失則：

入射光 = 吸收光 + 透過光

原理

分光光度計采用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長的光源，光線透過測試的樣品后，部分光線被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。

單色光輻射穿過被測物質(zhì)溶液時，被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度（光路長度）成正比，其關(guān)系如下式：

A=-lg(I/I₀)=-lgT=kLc

式中 :A 為吸光度；

I₀為入射的單色光強度；

I 為透射的單色光強度；

T 為物質(zhì)的透射率；

k 為摩爾吸收系數(shù)；

L 為被分析物質(zhì)的光程，即比色皿的邊長；

c 為物質(zhì)的濃度；

物質(zhì)對光的選擇性吸收波長，以及相應的吸收系數(shù)是該物質(zhì)的物理常數(shù)。當已知某純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)后可用同樣條件將該供試品配成溶液，測定其吸收度,即可由上式計算出供試品中該物質(zhì)的含量。在可見光區(qū)，除某些物質(zhì)對光有吸收外，很多物質(zhì)本身并沒有吸收但可在一定條件下加入顯色試劑或經(jīng)過處理使其顯色后再測定,故又稱比色分析。由于顯色時影響呈色深淺的因素較多，且常使用單色光純度較差的儀器，故測定時應用標準品或?qū)φ掌吠瑫r操作。

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